猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒使用操作说明书

【名称】

【作用与用途】

猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒（Blocking ELISA Kit For Classical Swine Fever Virus Antibody test）用于检测猪血清中的CSFV特异性抗体，评估养猪场CSFV疫苗免疫状况以及感染猪的血清学辅助诊断。

【检测原理】

本试剂盒采用阻断ELISA法，在酶标板条微孔上预包被猪瘟病毒抗原。在实验中，加入样品稀释液和待检血清，经过温育后，若样品中含有CSFV特异性抗体，则与包被板上抗原结合。经洗涤后除去未结合的抗体和其他成分后，再加入酶标抗体，样本中的抗体阻断了酶标抗体与包被板上的抗原结合。再经洗涤除去未结合的酶结合物，在微孔板中加入底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450 nm波长测定反应孔中的吸光度OD值。

【主要成分与含量】

抗原包被板	1 板/2 板	底物 A 液	12 mL
阴性对照	2 mL	底物 B 液	12 mL
阳性对照	2 mL	终止液	12 mL
酶标抗体浓缩液	0.24 mL	10×浓缩洗涤液	75 mL
酶标抗体稀释液	24 mL	盖板膜	1 张/2 张
样品稀释液	15 mL	说明书	1 份

【需自备的材料】去离子水、微量移液器、酶标仪（450 nm）、计时器、离心机（4000 rpm）等。

【用法与判定】

1、用法

1.1 试剂配制

洗涤工作液：使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（20～25℃），并摇动，使沉淀溶解（最好在 37℃恒温培养箱中加热 5～10 min），然后用蒸馏水作 10 倍稀释（例如：75mL 的浓缩洗涤液加上675mL 蒸馏水）混匀，稀释好的洗涤液 2～8℃可存放 7 日。

1.2 样本处理

取动物全血，待血液凝固后，4000 rpm 离心 10 min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，无溶血。注：阴、阳性对照不用稀释。

1.3 操作步骤

① 取抗原包被板（根据样品多少，可拆开分次使用），设阴、阳性对照各 2 孔，取阴性、阳性对照各 100 µL 分别加入反应孔中。其他孔加入样品稀释液 50 µL/孔，然后加入待检血清 50 µL/孔。轻轻振匀孔中样品，盖上盖板膜，37℃避光反应 30 min。 ② 弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液 300 µL，静置1min 后，弃去洗涤液。洗涤 4 次后在吸水纸上拍干。

③ 配制酶标抗体工作液:按体积比 1:100（1 份酶标抗体浓缩液+99 份酶标抗体稀释液）混匀备用。

④ 每孔加酶标抗体工作液 100 µL，盖上盖板膜，37℃避光反应30 min。 ⑤ 弃去孔中的溶液，洗涤 4 次，方法同②。

⑥ 将底物 A 液与底物 B 液按 1:1 混合，加入孔中，100 µL/孔，盖上盖板膜，37℃避光反应 10 min。 ⑦ 每孔加入终止液 50 µL，5 min 内测定结果。

2、判定

在酶标仪上读各孔 OD450nm 值。

① 试验成立的条件：

阴性对照平均 OD450nm 值≥1.0 且阳性对照 P（阻断率）≥ I 50%，试验结果才有效；否则，应进行重复试验。

② 计算方法：

PI（阻断率）=100%-(样品 OD 值÷阴性 OD 均值)×100%

③ 阴阳性判断：

PI≥40%时，判为阳性；PI＜40%时，判为阴性。

【注意事项】