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    聚合酶链反应(PCR)实验操作四个故障现象原因解析与解决办法

    日期:2021-10-18 | 中海生物技术文库 | 浏览:53 次

    聚合酶链反应(PCR)物质的电泳技术检测标准,通常情况下为两天时间范围之内,最好能当天检验完成,超过两天后带型不规律以至于消退。但有时候仍会与到如此这样的現象,直接影响检验最终结果的判定,中海生物技术按照实际分类整理PCR(www.zhzbio.com)聚合酶链反应实验四个故障现象原因解析与解决办法如下所述:

    聚合酶链反应(PCR)实验操作四个故障现象原因解析与解决办法

    状况 故障现象 原因分析 解决办法
    ㈠无扩增物质 正比对有条带,而样本则无

    ①样例:内含抑制物,占比低

    ②Buffer对样本不适宜

    ③引物设计不善或是会出现降解

    ④反应必要条件:退火温度太高,扩展时长过短

    ❶纯化样例或是采用检测试剂盒获取样例DNA或增加样例的用量

    ❷替换Buffer或调节浓度值

    ❸再次设计引物(避免出现链间二聚体和链内二级结构)或是换一管新引物

    ❹降低退火温度、增加扩展时长

    ㈡非特异性扩增 条带与预计的尺寸不一致或是非特异性扩增带

    ①引物特异性差

    ②样例或引物浓度过高

    ③酶量太多

    ④Mg2+浓度值较高

    ⑤退火温度低于正常

    ⑥反复频次太多

    ❶再次设计引物或是采用巢式PCR

    ❷适度降低样例或引物浓度

    ❸适度降低酶量

    ❹降低镁离子浓度值

    ❺适度提升 退火温度或采用二周期温度法

    ❻降低反复频次

    ㈢拖尾 物质在凝胶上呈Smear状况

    ①样例不纯

    ②Buffer不适宜

    ③退火温度低于正常

    ④酶量太多

    ⑤dNTP和Mg2+浓度值较高

    ⑥反复频次太多

    ❶纯化样例

    ❷替换Buffer

    ❸适度提升 退火温度

    ❹适量用酶

    ❺适度降低dNTP和镁离子的浓度值

    ❻降低反复频次

    ㈣假阳性 空白对照会出现目的扩增物质 靶序列或扩增物质的交叉性污染

    ❶基本操作的时候要注意柔和,以防将靶序列吸取到加样枪内或喷溅离心管外;

    ❷除酶及不可以耐超高温的物质外,全部实验试剂或器械均应髙压消毒杀菌。所使用离心管及加样器枪头等均应一次性使用。

    ❸各种各样实验试剂最佳先完成分开包装,随后较低温度贮藏

     


    本文链接:https://www.zhzbio.com/news/wenku-pcrguzhangxianxiang.html 中海生物技术


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