聚合酶链反应(PCR)实验操作四个故障现象原因解析与解决办法
日期：2021-10-18 | 中海生物技术文库 | 浏览：930 次
聚合酶链反应(PCR)物质的电泳技术检测标准，通常情况下为两天时间范围之内，最好能当天检验完成，超过两天后带型不规律以至于消退。但有时候仍会与到如此这样的現象，直接影响检验最终结果的判定，中海生物技术按照实际分类整理PCR(www.zhzbio.com)聚合酶链反应实验四个故障现象原因解析与解决办法如下所述：
聚合酶链反应(PCR)实验操作四个故障现象原因解析与解决办法
| 状况 | 故障现象 | 原因分析 | 解决办法 |
| ㈠无扩增物质 | 正比对有条带，而样本则无 |
①样例:内含抑制物，占比低 ②Buffer对样本不适宜 ③引物设计不善或是会出现降解 ④反应必要条件：退火温度太高，扩展时长过短 |
❶纯化样例或是采用检测试剂盒获取样例DNA或增加样例的用量 ❷替换Buffer或调节浓度值 ❸再次设计引物（避免出现链间二聚体和链内二级结构）或是换一管新引物 ❹降低退火温度、增加扩展时长 |
| ㈡非特异性扩增 | 条带与预计的尺寸不一致或是非特异性扩增带 |
①引物特异性差 ②样例或引物浓度过高 ③酶量太多 ④Mg2+浓度值较高 ⑤退火温度低于正常 ⑥反复频次太多 |
❶再次设计引物或是采用巢式PCR ❷适度降低样例或引物浓度 ❸适度降低酶量 ❹降低镁离子浓度值 ❺适度提升 退火温度或采用二周期温度法 ❻降低反复频次 |
| ㈢拖尾 | 物质在凝胶上呈Smear状况 |
①样例不纯 ②Buffer不适宜 ③退火温度低于正常 ④酶量太多 ⑤dNTP和Mg2+浓度值较高 ⑥反复频次太多 |
❶纯化样例 ❷替换Buffer ❸适度提升 退火温度 ❹适量用酶 ❺适度降低dNTP和镁离子的浓度值 ❻降低反复频次 |
| ㈣假阳性 | 空白对照会出现目的扩增物质 | 靶序列或扩增物质的交叉性污染 |
❶基本操作的时候要注意柔和，以防将靶序列吸取到加样枪内或喷溅离心管外； ❷除酶及不可以耐超高温的物质外，全部实验试剂或器械均应髙压消毒杀菌。所使用离心管及加样器枪头等均应一次性使用。 ❸各种各样实验试剂最佳先完成分开包装，随后较低温度贮藏 |
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